Menurut Suryowinoto (1991), kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya.
Kultur jaringan akan lebih besar presentase keberhasilannya bila menggunakan jaringan meristem. Jaringan meristem adalah jaringan muda, yaitu jaringan yang terdiri dari sel-sel yang selalu membelah, dinding tipis, plasmanya penuh dan vakuolanya kecil-kecil. Kebanyakan orang menggunakan jaringan ini untuk tissue culture. Sebab, jaringan meristem keadaannya selalu membelah, sehingga diperkirakan mempunyai zat hormon yang mengatur pembelahan.
Teknik kultur jaringan sebenarnya sangat sederhana, yaitu suatu sel atau irisan jaringan tanaman yang sering disebut eksplan secara aseptik diletakkan dan dipelihara dalam medium pada atau cair yang cocok dan dalam keadaan steril. dengan cara demikian sebaian sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami proliferasi dan membentuk kalus. Apabila kalus yang terbentuk dipindahkan kedlam medium diferensiasi yang cocok, maka akan terbentuk tanaman kecil yang lengkap dan disebut planlet. Dengan teknik kultur jaringan ini hanya dari satu irisan kecil suatu jaringan tanaman dapat dihasilkan kalus yang dapat menjadi planlet dlama jumlah yang besar.
Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman ini berdasarkan teori sel sperti yang dikemukakan oleh Schleiden, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotensi adalah kemampuan setiap sel, darimana saja sel tersebut diambil, apabila diletakkan dilingkungan yangsesuai akan tumbuh menjadi tanaman yang sempurna.
Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplan sebagai bahan dasar untuk pembentukkan kalus, penggunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair. Meskipun pada prinsipnya semua jenis sel dapat ditumbuhkan, tetapi sebaiknya dipilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, seperti: daun muda, ujung akar, ujung batang, keping biji dan sebagainya. Bila menggunakan embrio bagian bji-biji yang lain sebagai eksplan, yang perlu diperhatikan adalah kemasakan embrio, waktu imbibisi, temperatur dan dormansi.
2. BAB II (MANFAAT KULTUR JARINGAN)
Kegunaan utama dari kultur jaringan adalah untuk mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat, yang mempunyai sifat fisiologi dan morfologi sama persis dengan induknya. Dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul. Secara lebih rinci dan jelas berikut ini akan dibahas secara khusus kegunaan dari kultur jaringan terhadap berbagai ilmu pengetahuan.
Perbanyakan tanaman secara besar-besaran telah dibuktikan keberhasilannya pada perkebunan kelapa sawit dan tebu. Dengan car kultur jaringan dapat klon suatu komoditas tanaman dalam relatif cepat. Manfaat yang dapat diperoleh dari kloning ini cukup banyak, misalnya: di luar pulau Jawa akan didirikan suatu perkebunan yang membutuhkan bibit tanaman dalam jumlah ribuan, maka sudah dapat dibayangkan betapa mahalnya biayanya hanya untuk trasnportasi saja. Hala ini dapat diatasi denga usaha kloning melalui budaya jaringan, karena hanya perlu membawa beberapa puluh botol planlet yang berisi ribuan bibit. Dengan cara ini dapat menghemat waktu dan biaya yang cukup banyak dalam persiapan pemberangkatan ataupun transportasinya. Pada ekspor anggrek, misalnya, orang luar negeri menghendaki bunga anggrek yang seragam baik bentuk maupun warnanya. Dalam hal ini dapat dipenuhi juga dengan usaha kloning. Bibit-bibit tanaman dari usaha mericlono (tanaman hasil budidaya meristem) akan berharga lebih mahal, karena induknya dipilih dari tanaman yang mempunyai sifat paling bagus (unggul).
Kultur jaringan tanaman telah dikenal banyak orang sebagai usaha mendapatkan varietas baru (unggul) dari suatu jenis tanaman dalam waktu yang relatif lebih singkat dari pada dengan cara pemuliaan tanaman yang harus dilakukan penanaman secara berulang-ulang sampai beberapa generasi. Untuk mendapatkan varietas baru melalui kultur jaringan dapat dilakukan dengan cara isolasi protoplas dari 2 macam varietas yang difusikan. Atau dengan cara isolasi khloroplas suatu jenis tanaman yang dimasukkan kedalam protoplas jenis tanaman yang lain, sehingga terjadi penggabungan sifat-sifat yang baik dari kedua jenis tanaman tersebut hingga terjadi hibrid somatik. Cara yang lain adalah dengan menyuntikkan protoplas dari suatu tanaman ketanaman lain. Contohnya transfer khloroplas dari tanaman tembakau berwarna hijau ke dalam protoplas tanaman tembakau yang albino, hasilnya sangat memuaskan karena tanaman tembakau menjadi hijau pula. Contoh lain adalah keberhasilan mentrasnfer khloroplas dari tanaman jagung ke dalam protoplas tanaman tebu hasilnya memuaskan (Anik Herawati, 1991).
Khloroplas yang ditransfer harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:
* Sewaktu dilakukan isolasi, khloroplas harus sempurna.
* Setelah diisolasi harus mempuyai sifat yang sama dengan khloroplas yang tumbuh secara in vivo (budidaya biasa).
* Setelah diisolasi masih mempunyai sifat atau aktivitas fotosintesa yang cukup tinggi.
Contoh isolasi protoplas dalam budidaya jaringan yang sangat berguna adalah ditemukannya sun-chlorella (jenis ganggang). Ganggang ini secara enzimatis dijadikan protoplas (sel-selnya ditelanjangi dengan cara diinkubasikan dalam enzim medium sehingga dinding selnya larut), kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari. Protoplas tersebut selanjutnya dipecah hingga didapatkan khloroplas dan akhirnya dibuat pil-pil untuk pengobatan.
Menciptakan varietas baru dapat pula dilakukan dengan menggunakan bantuan jenis bakteri seperti bakteri penyebab tumor yang disebut Agrobacterium tumifaciens. Bakteri ini disuntikkan pada tanaman sehat mempunyai buah ukuran besar, agar tanaman sehat tersebut menjadi sakit tumor. Bakteri yang berada dalam jaringan yang menonjol karena terkena tumor tersebut kemudian diambil dan disuntikkan kedalam tanaman lain yang ukuran buahnya kecil-kecil. Dengan cara ini terbukti bahwa tidak lam kemudian tanaman tersebut menghasilkan buah yang ukurannya besar. Hal ini membuktikan bahwa bakteri yang dipindahkan tersebut membawa sifat keturunan yang ada pada tanaman semula. Sedangkan untuk mendapatkan yang baru yang tahan terhadap stress garam, pestisida tertentu, logam berat, suhu rendah atau tinggi dan sebagainya dapat dilakukan dengan cara-cara khusus.
Menciptakan tanaman baru yang toleran terhadap stress garam pernah dilakukan oleh Handa dkk. (Suryowinoto, 1985) yaitu terhadap tanaman tomat dan tembakau. Pada penelitian ini menggunakan penambahan PEG (Poly Ethilen- Glycol) atau NaCL, yang biasa dipergunakan untuk mendapatkan kultivar yang toleransi terhadap garam.
Beberapa jenis tanaman ada yang teramcam punah (endangered species), misalnya berbagai jenis tanaman pisang, tanaman melati, kenanga, kayu jati, dan kayu putih. Usaha yang paling tepat untuk melestarikan tanaman yang terancam punah adalah dengan jalan kloning. Dengan usaha kloning ini, populasi dari tanaman tersebut akan terselamatkan, bahkan dapat bertambah, sekaligus sifat-sifat yang dimiliki oleh tanaman tersebut tetap terjamin.
Kultur jaringan juga mempunyai manfaat yang besar dibidang farmasi, karena dari usaha ini dapat dihasilkan metabolit skunder upaya untuk pembuatan obat-obatan, yaitu dengan memisahkan unsur-unsur yang terdapat di dalam kalus ataupun protokormus, misalnya alkoloid, steroid, dan terponoid. Dengan ditemukannya cara mendapatkan metabolit skunderdari kalus suatu eksplan yang di tumbuhkan dalam medium kultur jaringan, mak berarti dapat menghemat waktu dan tenaga. Dengan cara biasa, untuk mendapatkannya harus menunggu lama samapai tanaman cukup umur bahkan sampai berproduksi hingga bertahun-tahun. Sedangkan dengan teknik kultur jaringan hanya membuthkan waktu antara tiga minggu sampai satu bulan saja. Metabolit yang dihasilkan dari kalus ternyata juga memiliki kadar yang lebih tinggi daripada dengan cara biasa (langsung dari tanaman). Dengan cara pengambilan metabolit skunder dari kalus, biasanya selalu diperoleh kandungan lain yang lebih banyak jenisnya, karena seringkali timbul zat-zat alkaloid atau persenyawaan-persenyawaan lainnya yang sangat berguna untuk pengobatan.
Persenyawaan yang bermanfaat yang diambil dari kalus dapat ditingkatkan kadarnya dengan cara memanipulasinya, antara lain:
* Memakai medium lain yang sesuai.
* Mengubah salah satu kadar komponen dalam medium.
* Memberi zat tambahan tertentu ke dalam medium, misalnya penambahan zat pengatur tumbuh auksin ataupun sitokinin.
Kultur jaringan juga memberikan masukkan atau informasi pengetahuan yang sangat bermanfaat dibidang fisiologi tanaman. Pada tanaman anggrek misalnya, telah berhasil diketahui bahwa jika ujung akarnya diiris melintang akan memperlihatkan warna tertentu. Warna tersebut nantinya akan sama dengan warna bunganya. Hal ini sangat berguna dalam bidang perdangan bunga hias, sebab walaupun tanamannya belum berbunga orang sudah dapat mengetahui warna bunga yang akan muncul.
Melalui perbanyakan vegetatif dengan kultur jaringan ternyata juga berpengaruh terhadap devisa negara. Misalnya, denagn terlaksananya ekspor tanaman anggrek ke negara lain, maka akan menaikkan devisan negara dibidang pertanian.
Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang belum biasa dilaksanakan oleh para petani, baru beberapa kalangan pengusaha swasta saja yang sudah mencoba melaksanakannya, karena pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman memerlukan keterampilan khusus dan harus diltar belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar tentang fisiologi tumbuhan, anatomi tumbuhan, biologi, kimia dan pertanian. Dengan demikian jelas akan amat sulit untuk diterima oleh kalangan petani biasa. Di samping itu, pelaksanaan teknik kultur jaringan mutlak memerlukan laboratorium khusus, walaupun dapat di usahakan secara sederhana (dalam ruang yang terbatas), namun tetap memerlukan peralatan yang memadai. Kemungkinan lain petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik. Karena semua pekerjaan harus dilaksanakan secara hatri-hati dan cermat serta memerlukan kesabaran yang tinggi. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman cecara in vitro ini juga sangat mahal, kecuali kita meramu medium sendiri. Bila kia terpaksa harus membeli medium yang sudah jadi (dalam kemasan) jelas akan sangat mahal, sebab medium yang sudah jadi masih harus di impor dari luar negeri. Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi protoplas, tentu biayanya akan bertambah besar. Enzim-enzim yang digunakan dalam kultur jaringan juga masih dibeli dari luar negeri sepertti Jepang.
Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas, kita harus mengakui bahwa teknik kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan, terutama untuk pengembangan bioteknologi.
BIOTEKNOLOGI
ILMU-ILMU DASAR ILMU TERAPAN
MIKROBIOLOGI KULTUR JARINGAN
BIO KIMIA REKAYASA
BIOLOGI MOLEKULER TEKNOLOGI
EMBRIO TUMBUHAN REKOMBINAN
GENETIKA
3. BAB III (ALAT-ALAT LABORATORIUM KULTUR JARINGAN)
A. Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)
Alat ini letaknya diruang penabur, yaitu ruang yang selalu harus dalam keadaan steril. alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman.
B. Entkas
Merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC), maka fungsinya pun sama seperti (LAFC)
C. Shaker (penggojok)
Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita. Penggojok ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan kalus pada eksplan anggrek atau untuk membentuk protokormusatau sering disebut plb (protocorm like bodies) dari kalus bermacam jaringan tanaman.
D. Autoklaf
Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jarinang tanaman.
E. Timbangan Analitik
Jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah timbanagn yaang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat keil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan.
F. Stirer
Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai penggojok.
G. Erlenmeyer
Alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana mmenuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eeksplan.
H. Gelas Ukur
Gelas ukur digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan digunakan.
I. Gelas Piala
Alat ini digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling dalam pembuatan medium.
J. Petridish
Alat ini merupakan semacam jenis gelas piala yang mutlak dibutuhkan dalam kultur jaringan.
K. Pinset dan Scalpel
Pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan
L. Lampu Spiritus
Digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar air flow cabinet atau di dalam enkas pada kita mengerjakan penanaman atau sub-culture.
M. Tabung Reaksi
Alat ini digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas.
4.BAB IV (FASILITAS LABORATORIUM KULTUR JARINGAN)
Fasilitas laboratorium kultur jaringan di bagi dalam beberapa bagian yang fungsinya satu sama lainnya berbeda-beda dan persyaratannya pun berbeda-beda pula. Laboratorium kultur jaringan harus dirancang secara khusus. Karena ada bagian-bagian atau ruangan-ruanagn yang harus dalam suasana steril atau bebas mikroba.
Ruang-ruang dalam kultur jaringan di kelompokkan menurut macam kegiatan yang ada di dalamnya,, yaitu sebagai berikut:
A. Ruang Tidak Steril
* Ruang Tamu.
Dalam laborsatorium kultur jaringan sebaiknya di lengkapi dengan ruang tamu, karena biasanya laboratorium kultur jaringan selalu di datangi tamu baik tamu yang ingin melihat sarana dan suasana laboratorium maupun tamu ingin membeli hasil biakan kultur jaringan.
* Ruang Administrasi.
Segala surat-menyurat tentang pembelian alat-alatlboratorium, pembelian media kultur jringan, penjualan bibit-bibit hasil biakan kultur jaringan, dan transaksi-transaksi ataupun perjanjian-perjanjian kerja sama tentang penelitian dilaksanakan di dalam ruangan administrasi.
* Ruang Staf.
Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf peneliti dalam jumlah banyak, tujuannya adalah agar dapat di adakan pembagian kerja sesuai dengan spesialisasinya masing-masing. Di dalam ruang staf ini dapat pula di lakasanakan diskusi antar staf pada waktu berkumpul bersama.
* Kamar Mandi dan WC.
Ruang kultur jaringan harus dalam suasana bersih untuk menghindari kontaminasi oleh mikroba. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau ruang inkubator, tubuh dan pakaiannya harus bersih, tidak berkeringat dan tidak berdebu. Untuk inilah kamar mandi dan wc perlu diadakan.
* Ruang Ganti Pakaian.
Untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba, maka para karyawan di dalam laboratorium kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih, dalam arti baru di cuci. Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di adakan ruang ganti pakaian.
* Ruang Tempat Penyimpanan Bahan Kimia dan Alat-alat dari Gelas.
Komponen bahan kimia penyusun media kultur jaringan sangat banyak macamna. Oleh karena itu, penyimpanannya memerlukan pengaturn yang khusus supaya mudah mecarinya. Penyimpanan yang tidak teratur akan mempelambat dalam pekerjaan, misalnya dalam mencari salah sau komponen media saja membutuhkan waktu yang lama.
Bahan kimia yang mahal harganya seperti hormon tumbuh dan enzim untuk isolasi protoplas harus disimpan dala ruangan yang sejuk.
Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer, gelas ukurdan alat gelas lainnya perlu disimpan dalam almari tersendiri.
* Ruang Preparasi.
Di dalam ruangan ini disediakan peralatan dan tempat untuk mencuci alat-alat laboratorium yang akan digunakan. Peralatan yang ada antara lain keranjang-keranjang plastik untuk tempat peralatan yang baru dicuci.
* Ruang Penimbangan dan Sterilisasi.
Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam bentuk kemasan dengan harga yang relatif mahal. Oleh karena itu, staf labolatorium lebih senang meramu sendiri medum tanam yang dibutuhkannya.dengan demikian dibutuhkan lat untuk menimbang semua komponen bahan kimia tersebut. Misalnya menimbang bahan kimia makro dan mikro.
* Rumah Kaca (Green House)
Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan sekeliling dinding bagian atasnya terbuat dari kaca. Tujuan penyediaan rumah kaca adalah untuk tempat meletakkan pot-pot bibit tanaman, baik bibit yang akan dijadikan bahan kultur jarinang maupun bibit hasil dari kultur jaringan yang sudah siap djual atau dipelihara sendiri.
B. Ruang Tidak Mutlak Steril
* Ruang Planlet.
Ruangan ini menggunakan alat pendingi (AC), maka temperatur ruangan dapat mencapai sekitar 25OC sehingga ideal bagi pertumbuhan planlet. Botol-botol yang berisi planlet jumlahnya dapat mencapai ratusan. Oleh sebab itu, dalam ruangan ini perlu disediakan rak-rak alumuniaum yang dasrnya berlobang-lobang untuk meletakkan botol-botol tersebut secara teratur dan rapi.
* Ruang Inkubator.
Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur jringan perlu dipantau pertumbuhannya setiap hari. Untuk pemantauan ini perlu ruangan khusus yang keadaannya lebih steril dari ruang planlet, yaitu ruang inkubator.
Ruang inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25OC dan harus dilengkapi dengan lampu-lampu neon, karena eksplan yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi membutuhkan temperatru dan cahaya yang dapat diatur dan disesuaikan dengan jenis eksplannya.
* Ruang Shaker dsn Enkas.
Eksplan yang baru ditanam dan diinkubasikan dalam ruang inkubator akan menghasilkan kalus. Bila kalus ini cukup umur, maka dapat diperlukan suspensi sel, yaitu menumbuhkan suatu eksplan atau kalus dengan menggunakan media cair (media yang tidak menggunakan zat pemadat atau agar), kemudian digojok di atas shaker.
Hasil pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam istilah asing disebut plb (protocorm like bodies). Bentuk protocormus adalah bulat-bulat padat dan berwarna hijau. Bila keadaan protocormus sudah keadaan demikian maka sudah siap dipindahkan kedalam media padat untuk di tumbuhkan menjadi planlet.
Enksa juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker, kegunaan enkas ini sama dengan Laminar Air Flow Cabinet, yaitu untuk menabur eksplan.
C. Ruang Mutlak Steril.
* Ruang Penabur.
Ruang penabur biasanya di buat dengan ukuran yang tidak terlalu besar, yaitu 2x3 m2. tujuannya adalah agar pelaksanaan sterilisasi ruangannya tidak membutuhkan waktu yang lama dan tidak mengalami kesulitan.
Dinding ruang penabur dilengkapi dengan porselin, sehingga sterilisasi mudah dilakukan. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 96% dengan hand-sprayer. Sedangkan sterilisasi lantai dengan menggunakan kain pel yang dibasahi alkohol 96%. Sterilisasi ini mutlak harus dilakukan menjelang ruang penabur akan digunakan.
Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan, lampu ultra violet harus dimatkan terlebih dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur diperbolehkan memasuki ruangan tersebut. Sebaiknya, pada saat akan keluar lampu neon di matikan dan setelah keluar menutup daun pintu kembali lampu ultra violet dinyalakan. Dengan demikian steril ruangan dapat dijamin.
5. BAB V (MEDIA TANAM KULTUR JARINGAN)
A. Unsur-unsur yang Dibutuhkan Tanaman
Sebelum menguraikan cara-cara membuat medium kultur jaringan, maka terlebih dahulu kita harus mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman. Unsur-unsur yang dibuthkan tanaman dikelompokkan menjadi:
1. Garam-garam Anorganik
Setiap tanaman membutuhkan paling sedikit 16 unsur untuk pertumbuhannya yang normal. Tiga unsur di antaranya adalah C,H,O yang di ambil dari udara, sedangkan 13 unsur yang lain berupa pupuk yang dapat diberikan melalui akar atau melalui daun. Pada perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Semua unsur tersebut dibutuhkan oleh tanaman untuk pertumbuhannya. Ada unsur yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah besar yang disebut unsur makro, ada pula yang dibutuhkan oleh tanaman dalam jumlah sedikit tetapi harus tersedia yang disebut unsur mikro.
2. Zat-zat Organik
Zat-zat organik yang biasanya ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah sukrosa, mio inositol, asam amino, dan zat pengatur tumbuh. Sedangkan sebagai tambahan biasanya diberi zat organik lain seperti air kelapa, ekstrak ragi, pisang, tomat, toge dan lain-lain.
B. Kegunaan Setiap Unsur Bagi Tanaman
setelah kita mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan oleh tanaman, maka sebelum kita menentukan unsur-unsur yang akan digunakan untuk meramu medium kultur jaringan perlu mengetahui terlebih dahulu kegunaan unsur-unsur tersebut bagi pertumbuhan tanaman atau jaringan tanaman.
1. Unsur Nitrogen (N)
Kegunaan unsur Nitrogen bagi tanaman adalah untuk menyuburkan tanaman, sebab unsur N dapat membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik yang lain.
2. Unsur Fospor (P)
Dibutuhkan oleh tanaman untuk membentuk karbohidrat. Maka, unsur P ini dibutuhkan secara besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih.
3. Unsur Kalium (K)
Memperkuat untuk tubuh tanaman, karena unsur ini dapat digunakan untuk memperkuat serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan buah tidak mudah gugur.
4. Unsur Sulpur (S)
Unsur ini digunakan untuk proses pembentukan anakan sehingga pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin.
5. Unsur Kalsium (Ca)
Digunakan untuk merangsang pembentukkan bulu-bulu akar, mengeraskan batang dan merangsang pembentukkan biji.
6. Unsur Magnesium (Mg)
Digunakan tanaman sebagai bahan mentah untuk ppembentukkan sejumlah protein.
7. Unsur Besi (Fe)
Unsur ini digunakan sebagai penyangga (chelati agint) yang sangat penting untuk menyagga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.
8. Unsur Sukrosa
Unsur ini sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus.
9. Unsur Glukosa atau Fruktosa
Unsur ini dapat digunakan sebagai unsur pengganti sukrosa karena dapat merangsang beberapa jaringan.
10. Unsur Mio-inositol
Penambahan unsur ini pada medium bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan.
11. Unsur Vitamin
Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam mediumklutur jaringan antara lain adalah Thiamin. Thiamin adalah vitamin esensial yang digunakan untuk medium kultur jaringan.
12. Unsur Asam Amino
Unsur ini diunakan oleh tanaman untuk proses pertumbuhan dan diferensiasi sel. Kebutuhan unsur asam amino oleh tanaman berbeda.
13. Unsur Zat Pengatur Tumbuh.
Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senywa organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman terdir dari lima kelompok yaitu, Auksin, Sitokinin, Giberelin, Etilen dan Inhibitor dengan ciri khas dan pengaruh yang berlainan terhadap proses fisiologis.
Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi. Tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium, pertumbuhan sangat terhambat bahkan tidak akan tumbuh sama sekali.
C. Bentuk Fisik Media Tanam
Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula , vitamin, protein, dan hormon tumbuh. media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti campuran-campuran zat kimia dengan air suling, sedangkan media padat adalah media zat cair tesebut ditambah dengan zat pemadat agar.
D. Faktor Lingkungan
1. Keasaman (pH)
Keasaman pH adalah nilai derazat keasaman atau kebasaan dari larutan dalam air. Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H dalam larutan. Nilai di dalam pH berkisar antara 0 (sangat asam) sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk netral adalah pH pada 7.
Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0-6,0. Bila eksplan mulai tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman umumnya akan naik apabila nutrein habis terpakai.
Pengukuran pH dapat dilakukan dengan menggunakan pH meter, atau bila menginginkan yang lebih praktis dan murah dapat digunakan kertas pH. Bila ternyata pH medium masih kurang normal, maka dapat ditambah KOH 1-2 tetes. Sedangkan apabila pH melampaui batas normal dinetralkan dengan penambahan HCL.
2. Kelembapan
Kelembapan relatif (RH) lingkungan biasanya mendekati 100%. RH sekeliling kultur mempengaruhi pola pengembangan. Jadi, pengaturan RH pada keadaan tertentu memerlukan suatu bentuk diferensiasi Khusus.
3. Cahaya
Intensitas cahaya yang rendah dapat mempertinggi embriogenesis dan organogenesis. Cahaya ultra violet dapat mendorong pertumbuhan dan pembentukan tunas dari kalus tembakau pada intesitas yang rendah.
4. Temperatur
Temperatur yang dibutuhkan untuk dapat terjadi pertumbuhan yang optimum umumnya adalah berkisar di antara 200-300C. Sedangkan temperatur yang optimum untuk pertumbuhan kalus endosperm adalah sekitas 250C.
E. Pembuatan Media Tanam
Sebelum membuat medium, maka terlebi dahulu kita harus menentukan medium apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalnya media Vacin Went sangat baik untuk media tumbuh anggrek. Tetapi tidak cocok untuk media tumbuh lain. Untuk eksplan dair tanaman keras sring menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Kundson C cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek.
Untuk membuat media kultur jaringan, biasanya menimbang setiap komponen bahan kimia yang terdapat pada resep medium dasar. Langkah ini kurang praktis karena memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu, timbangan yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Kendala ini dapat diatasi dengan membuat larutan stoc terlebih dahulu, kecuali untuk unsur makronya. Jadi perlu membuat larutan stoc mikro.
6.BAB VI (METODE PELAKSANAAN KULTUR JARINGAN)
A. Metode Kultur Jaringan.
1. Dilihat dari Macam Media Tanam
Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu:
a. Metode Padat (Solid Method)
Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-agar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur jaringan.
Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam. Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus, karena tempat area kalus yaitu pada irisan (jaringan yang luka) tertutup oleh medium.
Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning, untuk menumbuhkan protoplas stelah diisolasikan, untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan).
b. Metode Cair(Liquid Metho)
Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat, karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. Oleh karena itu, penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat yang sesuai.
Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita tidak p erlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein.
2. Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai
Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan, maka metode kultur jaringan yang telah dikenal sekarang antara lain adalah:
1) Kultur meristem.
2) Kultur antera
3) Kultru endosperma
4) Kultur suspensi sel
5) Kultur protoplas
6) Kultur embrio
7) Kultur spora
8) Dan lain-lain
3. Dilihat dari Cara Pemeliharaan
Eksplan yang telah ditanam, agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian menjadi planlet, membutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat. Artinya, eksplan atau kalus yang sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam yang baru harus segera dilaksanakan, tidak boleh sampai terlambat. Pemindahan yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat mengalami brownig atau terkontaminasi oleh jamur atau bakteri.
B. Pelaksanaan Kultur Jaringan
1. Sterilisasi Alat Penabur
Sebelum digunakan, enkas harus diterilisasi dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70%, dengan perbandinga 1:1. setelah disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan.
2. Sterilisasi Alat dan Medium
Alat-alat dissecting –set dan glass ware yang akan digunakan untuk kultur jaringan, setelah dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121 oC, tekanan 15 lb, dan lama sterilsiasi 20-30 menit.
Botol-botol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan alumunium foil, kemudian disterilisasi. Sterilisasi medium lebih sedikit waktunya dibandingkan dengan sterilisasi alat-alat, yakni 15 menit, tetapi suhu dan tekannya sama.
3. Sterilisasi Eksplan
Sterilisasi eksplan dilaksanakan dengan dua cara yaitu:
a. Sterilisasi Eksplan secara Mekanis
Cara ini digunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan membakar eksplan tersebut di atas lampu spirtus sebanyak tiga kali.
b. Sterilisasi Eksplan secara Kimiawi
Sterilisasi ini gunakan untuk eksplan yang lunak. Sterilisasi ini menggunakan bahan kimia. Bahan-bahan yang digunakan untuk sterilisasi:
* Sodium hipoklorit
* Mercuri chlorit
* Alkohol 70%
4. Menabur Eksplan
Menabur eksplan dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan kondisi aseptik. Sebelum kita bekerja di dalam laminar air flow cabinet, semua perhiasan tangan harus dilepas, dan tangan dibasuh terlebih dahulu dengan alkohol 70%.
Eksplan yang siap ditaman dipotng dengan menggunakan scalpel di dlam cawan petri. Potongan eksplan dimasukan kedalam erlenmeyer yang berisi media tumbuh, hingga permukaan yang teriris bersentuhan dengan medium.
Setelah semua pekerjaan menabur selesai, kemudian alat-alat yang sudah dipakai dibersihkan.
5. Melaksanakan Sub-Kultur
Dalam waktu satu sampai dua minggu, eksplan akan tumbuh menjadi kalus. Kalus adalah suatu masa sel yang terbentuk pada permukaan eksplan atau irisan eksplan. Kalus ini akan tumbuh pada media eksplan yang padat., sedangkan pada media cair akan tumbuh plb (protokormus)
Sub-kultur adalah suatu usaha untuk mengganti media kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk kalus atau protokormus dapat terpenuhi.
III. PEMBAHASAN
Dari hasil perbandingan antara buku yang saya buat ini bila dibandingkan dengan buku kultur jaringan yang lain ternyata pada laporan buku yang saya buat ini masih banyak kekurangannya yaitu:
* Masalah-masalah Dalam Kultur Jaringan
Dalam kegiatan kultur jaringan, tidak sedikit masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari bahan yang ditanam, dari lingkungan kultur, maupun dari manusianya.
Permasalahan dalam kultur ada yang dapat diprediksi sebelumnya dan ada pula yang sulit diprediksi kejadiannya. Untuk yang tidak dapat diprediksi, car mengatasinya tidak dapat secara preventif tetapi diselesaikan setelah kasus itu muncul.
Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu:
1) Kontaminasi
Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya.
Penomena kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll).
Upaya mencegah terjadinya kontaminsai.
* Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan.
* Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.
* Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar.
2) Pencoklatan/browning
Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi.
Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan.
3) Vitrifikasi
Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan:
* Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal.
* Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil.
* Pertrumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter
* Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent.
* Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade..
4) Variabilitas Genetik
Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upayapemuliaan tanaman maka variasi genetik adalah kendala. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena:
* Laju multiflikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol
* Penggunaan teknik yang tidak sesuai.
Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur suspensi sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin akibat teknis kultur, media atau hormon.
Cara mengatasi problem variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus memperhatikan aspek yang dikulturkan.
5) Pertumbuhan dan Perkembangan
Problem utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh.
Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel tua yang muda kembali.
Media juag dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya.
Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari sel-sel kalus. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen.
6) Praperlakuan
Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja, pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan.
Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis, fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif pengelolaannya.
7) Lingkunagn Mikro
Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan eksplan, suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan.
Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda, namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya.
Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain.
IV. SIMPULAN
Dari hasil pembuatan laporan buku ini dapat disimpulkan bahwa kultur jaringan. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya.
Manfaat dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul.
Dalam kegiatan kultur jaringan perlu memerlukan bahan-bahan yang dibutuhkan dalam proses kegiatan kultur jaringan. Bahan-bahan yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan diantaranya:
* Unsur hara makro dan mikro
* Zat Pengatur tumbuh
* Aquades
* Vitamin
* Agar
* Gula
* Ekstrak-ekstrak organik (ekstrak air kelapa, ekstrak tomat, dll)
Kultur jaringan akan lebih besar presentase keberhasilannya bila menggunakan jaringan meristem. Jaringan meristem adalah jaringan muda, yaitu jaringan yang terdiri dari sel-sel yang selalu membelah, dinding tipis, plasmanya penuh dan vakuolanya kecil-kecil. Kebanyakan orang menggunakan jaringan ini untuk tissue culture. Sebab, jaringan meristem keadaannya selalu membelah, sehingga diperkirakan mempunyai zat hormon yang mengatur pembelahan.
Teknik kultur jaringan sebenarnya sangat sederhana, yaitu suatu sel atau irisan jaringan tanaman yang sering disebut eksplan secara aseptik diletakkan dan dipelihara dalam medium pada atau cair yang cocok dan dalam keadaan steril. dengan cara demikian sebaian sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami proliferasi dan membentuk kalus. Apabila kalus yang terbentuk dipindahkan kedlam medium diferensiasi yang cocok, maka akan terbentuk tanaman kecil yang lengkap dan disebut planlet. Dengan teknik kultur jaringan ini hanya dari satu irisan kecil suatu jaringan tanaman dapat dihasilkan kalus yang dapat menjadi planlet dlama jumlah yang besar.
Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman ini berdasarkan teori sel sperti yang dikemukakan oleh Schleiden, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotensi adalah kemampuan setiap sel, darimana saja sel tersebut diambil, apabila diletakkan dilingkungan yangsesuai akan tumbuh menjadi tanaman yang sempurna.
Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplan sebagai bahan dasar untuk pembentukkan kalus, penggunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair. Meskipun pada prinsipnya semua jenis sel dapat ditumbuhkan, tetapi sebaiknya dipilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, seperti: daun muda, ujung akar, ujung batang, keping biji dan sebagainya. Bila menggunakan embrio bagian bji-biji yang lain sebagai eksplan, yang perlu diperhatikan adalah kemasakan embrio, waktu imbibisi, temperatur dan dormansi.
2. BAB II (MANFAAT KULTUR JARINGAN)
Kegunaan utama dari kultur jaringan adalah untuk mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat, yang mempunyai sifat fisiologi dan morfologi sama persis dengan induknya. Dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul. Secara lebih rinci dan jelas berikut ini akan dibahas secara khusus kegunaan dari kultur jaringan terhadap berbagai ilmu pengetahuan.
Perbanyakan tanaman secara besar-besaran telah dibuktikan keberhasilannya pada perkebunan kelapa sawit dan tebu. Dengan car kultur jaringan dapat klon suatu komoditas tanaman dalam relatif cepat. Manfaat yang dapat diperoleh dari kloning ini cukup banyak, misalnya: di luar pulau Jawa akan didirikan suatu perkebunan yang membutuhkan bibit tanaman dalam jumlah ribuan, maka sudah dapat dibayangkan betapa mahalnya biayanya hanya untuk trasnportasi saja. Hala ini dapat diatasi denga usaha kloning melalui budaya jaringan, karena hanya perlu membawa beberapa puluh botol planlet yang berisi ribuan bibit. Dengan cara ini dapat menghemat waktu dan biaya yang cukup banyak dalam persiapan pemberangkatan ataupun transportasinya. Pada ekspor anggrek, misalnya, orang luar negeri menghendaki bunga anggrek yang seragam baik bentuk maupun warnanya. Dalam hal ini dapat dipenuhi juga dengan usaha kloning. Bibit-bibit tanaman dari usaha mericlono (tanaman hasil budidaya meristem) akan berharga lebih mahal, karena induknya dipilih dari tanaman yang mempunyai sifat paling bagus (unggul).
Kultur jaringan tanaman telah dikenal banyak orang sebagai usaha mendapatkan varietas baru (unggul) dari suatu jenis tanaman dalam waktu yang relatif lebih singkat dari pada dengan cara pemuliaan tanaman yang harus dilakukan penanaman secara berulang-ulang sampai beberapa generasi. Untuk mendapatkan varietas baru melalui kultur jaringan dapat dilakukan dengan cara isolasi protoplas dari 2 macam varietas yang difusikan. Atau dengan cara isolasi khloroplas suatu jenis tanaman yang dimasukkan kedalam protoplas jenis tanaman yang lain, sehingga terjadi penggabungan sifat-sifat yang baik dari kedua jenis tanaman tersebut hingga terjadi hibrid somatik. Cara yang lain adalah dengan menyuntikkan protoplas dari suatu tanaman ketanaman lain. Contohnya transfer khloroplas dari tanaman tembakau berwarna hijau ke dalam protoplas tanaman tembakau yang albino, hasilnya sangat memuaskan karena tanaman tembakau menjadi hijau pula. Contoh lain adalah keberhasilan mentrasnfer khloroplas dari tanaman jagung ke dalam protoplas tanaman tebu hasilnya memuaskan (Anik Herawati, 1991).
Khloroplas yang ditransfer harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:
* Sewaktu dilakukan isolasi, khloroplas harus sempurna.
* Setelah diisolasi harus mempuyai sifat yang sama dengan khloroplas yang tumbuh secara in vivo (budidaya biasa).
* Setelah diisolasi masih mempunyai sifat atau aktivitas fotosintesa yang cukup tinggi.
Contoh isolasi protoplas dalam budidaya jaringan yang sangat berguna adalah ditemukannya sun-chlorella (jenis ganggang). Ganggang ini secara enzimatis dijadikan protoplas (sel-selnya ditelanjangi dengan cara diinkubasikan dalam enzim medium sehingga dinding selnya larut), kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari. Protoplas tersebut selanjutnya dipecah hingga didapatkan khloroplas dan akhirnya dibuat pil-pil untuk pengobatan.
Menciptakan varietas baru dapat pula dilakukan dengan menggunakan bantuan jenis bakteri seperti bakteri penyebab tumor yang disebut Agrobacterium tumifaciens. Bakteri ini disuntikkan pada tanaman sehat mempunyai buah ukuran besar, agar tanaman sehat tersebut menjadi sakit tumor. Bakteri yang berada dalam jaringan yang menonjol karena terkena tumor tersebut kemudian diambil dan disuntikkan kedalam tanaman lain yang ukuran buahnya kecil-kecil. Dengan cara ini terbukti bahwa tidak lam kemudian tanaman tersebut menghasilkan buah yang ukurannya besar. Hal ini membuktikan bahwa bakteri yang dipindahkan tersebut membawa sifat keturunan yang ada pada tanaman semula. Sedangkan untuk mendapatkan yang baru yang tahan terhadap stress garam, pestisida tertentu, logam berat, suhu rendah atau tinggi dan sebagainya dapat dilakukan dengan cara-cara khusus.
Menciptakan tanaman baru yang toleran terhadap stress garam pernah dilakukan oleh Handa dkk. (Suryowinoto, 1985) yaitu terhadap tanaman tomat dan tembakau. Pada penelitian ini menggunakan penambahan PEG (Poly Ethilen- Glycol) atau NaCL, yang biasa dipergunakan untuk mendapatkan kultivar yang toleransi terhadap garam.
Beberapa jenis tanaman ada yang teramcam punah (endangered species), misalnya berbagai jenis tanaman pisang, tanaman melati, kenanga, kayu jati, dan kayu putih. Usaha yang paling tepat untuk melestarikan tanaman yang terancam punah adalah dengan jalan kloning. Dengan usaha kloning ini, populasi dari tanaman tersebut akan terselamatkan, bahkan dapat bertambah, sekaligus sifat-sifat yang dimiliki oleh tanaman tersebut tetap terjamin.
Kultur jaringan juga mempunyai manfaat yang besar dibidang farmasi, karena dari usaha ini dapat dihasilkan metabolit skunder upaya untuk pembuatan obat-obatan, yaitu dengan memisahkan unsur-unsur yang terdapat di dalam kalus ataupun protokormus, misalnya alkoloid, steroid, dan terponoid. Dengan ditemukannya cara mendapatkan metabolit skunderdari kalus suatu eksplan yang di tumbuhkan dalam medium kultur jaringan, mak berarti dapat menghemat waktu dan tenaga. Dengan cara biasa, untuk mendapatkannya harus menunggu lama samapai tanaman cukup umur bahkan sampai berproduksi hingga bertahun-tahun. Sedangkan dengan teknik kultur jaringan hanya membuthkan waktu antara tiga minggu sampai satu bulan saja. Metabolit yang dihasilkan dari kalus ternyata juga memiliki kadar yang lebih tinggi daripada dengan cara biasa (langsung dari tanaman). Dengan cara pengambilan metabolit skunder dari kalus, biasanya selalu diperoleh kandungan lain yang lebih banyak jenisnya, karena seringkali timbul zat-zat alkaloid atau persenyawaan-persenyawaan lainnya yang sangat berguna untuk pengobatan.
Persenyawaan yang bermanfaat yang diambil dari kalus dapat ditingkatkan kadarnya dengan cara memanipulasinya, antara lain:
* Memakai medium lain yang sesuai.
* Mengubah salah satu kadar komponen dalam medium.
* Memberi zat tambahan tertentu ke dalam medium, misalnya penambahan zat pengatur tumbuh auksin ataupun sitokinin.
Kultur jaringan juga memberikan masukkan atau informasi pengetahuan yang sangat bermanfaat dibidang fisiologi tanaman. Pada tanaman anggrek misalnya, telah berhasil diketahui bahwa jika ujung akarnya diiris melintang akan memperlihatkan warna tertentu. Warna tersebut nantinya akan sama dengan warna bunganya. Hal ini sangat berguna dalam bidang perdangan bunga hias, sebab walaupun tanamannya belum berbunga orang sudah dapat mengetahui warna bunga yang akan muncul.
Melalui perbanyakan vegetatif dengan kultur jaringan ternyata juga berpengaruh terhadap devisa negara. Misalnya, denagn terlaksananya ekspor tanaman anggrek ke negara lain, maka akan menaikkan devisan negara dibidang pertanian.
Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang belum biasa dilaksanakan oleh para petani, baru beberapa kalangan pengusaha swasta saja yang sudah mencoba melaksanakannya, karena pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman memerlukan keterampilan khusus dan harus diltar belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar tentang fisiologi tumbuhan, anatomi tumbuhan, biologi, kimia dan pertanian. Dengan demikian jelas akan amat sulit untuk diterima oleh kalangan petani biasa. Di samping itu, pelaksanaan teknik kultur jaringan mutlak memerlukan laboratorium khusus, walaupun dapat di usahakan secara sederhana (dalam ruang yang terbatas), namun tetap memerlukan peralatan yang memadai. Kemungkinan lain petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik. Karena semua pekerjaan harus dilaksanakan secara hatri-hati dan cermat serta memerlukan kesabaran yang tinggi. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman cecara in vitro ini juga sangat mahal, kecuali kita meramu medium sendiri. Bila kia terpaksa harus membeli medium yang sudah jadi (dalam kemasan) jelas akan sangat mahal, sebab medium yang sudah jadi masih harus di impor dari luar negeri. Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi protoplas, tentu biayanya akan bertambah besar. Enzim-enzim yang digunakan dalam kultur jaringan juga masih dibeli dari luar negeri sepertti Jepang.
Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas, kita harus mengakui bahwa teknik kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan, terutama untuk pengembangan bioteknologi.
BIOTEKNOLOGI
ILMU-ILMU DASAR ILMU TERAPAN
MIKROBIOLOGI KULTUR JARINGAN
BIO KIMIA REKAYASA
BIOLOGI MOLEKULER TEKNOLOGI
EMBRIO TUMBUHAN REKOMBINAN
GENETIKA
3. BAB III (ALAT-ALAT LABORATORIUM KULTUR JARINGAN)
A. Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)
Alat ini letaknya diruang penabur, yaitu ruang yang selalu harus dalam keadaan steril. alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman.
B. Entkas
Merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC), maka fungsinya pun sama seperti (LAFC)
C. Shaker (penggojok)
Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita. Penggojok ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan kalus pada eksplan anggrek atau untuk membentuk protokormusatau sering disebut plb (protocorm like bodies) dari kalus bermacam jaringan tanaman.
D. Autoklaf
Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jarinang tanaman.
E. Timbangan Analitik
Jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah timbanagn yaang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat keil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan.
F. Stirer
Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai penggojok.
G. Erlenmeyer
Alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana mmenuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eeksplan.
H. Gelas Ukur
Gelas ukur digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan digunakan.
I. Gelas Piala
Alat ini digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling dalam pembuatan medium.
J. Petridish
Alat ini merupakan semacam jenis gelas piala yang mutlak dibutuhkan dalam kultur jaringan.
K. Pinset dan Scalpel
Pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan
L. Lampu Spiritus
Digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar air flow cabinet atau di dalam enkas pada kita mengerjakan penanaman atau sub-culture.
M. Tabung Reaksi
Alat ini digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas.
4.BAB IV (FASILITAS LABORATORIUM KULTUR JARINGAN)
Fasilitas laboratorium kultur jaringan di bagi dalam beberapa bagian yang fungsinya satu sama lainnya berbeda-beda dan persyaratannya pun berbeda-beda pula. Laboratorium kultur jaringan harus dirancang secara khusus. Karena ada bagian-bagian atau ruangan-ruanagn yang harus dalam suasana steril atau bebas mikroba.
Ruang-ruang dalam kultur jaringan di kelompokkan menurut macam kegiatan yang ada di dalamnya,, yaitu sebagai berikut:
A. Ruang Tidak Steril
* Ruang Tamu.
Dalam laborsatorium kultur jaringan sebaiknya di lengkapi dengan ruang tamu, karena biasanya laboratorium kultur jaringan selalu di datangi tamu baik tamu yang ingin melihat sarana dan suasana laboratorium maupun tamu ingin membeli hasil biakan kultur jaringan.
* Ruang Administrasi.
Segala surat-menyurat tentang pembelian alat-alatlboratorium, pembelian media kultur jringan, penjualan bibit-bibit hasil biakan kultur jaringan, dan transaksi-transaksi ataupun perjanjian-perjanjian kerja sama tentang penelitian dilaksanakan di dalam ruangan administrasi.
* Ruang Staf.
Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf peneliti dalam jumlah banyak, tujuannya adalah agar dapat di adakan pembagian kerja sesuai dengan spesialisasinya masing-masing. Di dalam ruang staf ini dapat pula di lakasanakan diskusi antar staf pada waktu berkumpul bersama.
* Kamar Mandi dan WC.
Ruang kultur jaringan harus dalam suasana bersih untuk menghindari kontaminasi oleh mikroba. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau ruang inkubator, tubuh dan pakaiannya harus bersih, tidak berkeringat dan tidak berdebu. Untuk inilah kamar mandi dan wc perlu diadakan.
* Ruang Ganti Pakaian.
Untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba, maka para karyawan di dalam laboratorium kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih, dalam arti baru di cuci. Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di adakan ruang ganti pakaian.
* Ruang Tempat Penyimpanan Bahan Kimia dan Alat-alat dari Gelas.
Komponen bahan kimia penyusun media kultur jaringan sangat banyak macamna. Oleh karena itu, penyimpanannya memerlukan pengaturn yang khusus supaya mudah mecarinya. Penyimpanan yang tidak teratur akan mempelambat dalam pekerjaan, misalnya dalam mencari salah sau komponen media saja membutuhkan waktu yang lama.
Bahan kimia yang mahal harganya seperti hormon tumbuh dan enzim untuk isolasi protoplas harus disimpan dala ruangan yang sejuk.
Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer, gelas ukurdan alat gelas lainnya perlu disimpan dalam almari tersendiri.
* Ruang Preparasi.
Di dalam ruangan ini disediakan peralatan dan tempat untuk mencuci alat-alat laboratorium yang akan digunakan. Peralatan yang ada antara lain keranjang-keranjang plastik untuk tempat peralatan yang baru dicuci.
* Ruang Penimbangan dan Sterilisasi.
Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam bentuk kemasan dengan harga yang relatif mahal. Oleh karena itu, staf labolatorium lebih senang meramu sendiri medum tanam yang dibutuhkannya.dengan demikian dibutuhkan lat untuk menimbang semua komponen bahan kimia tersebut. Misalnya menimbang bahan kimia makro dan mikro.
* Rumah Kaca (Green House)
Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan sekeliling dinding bagian atasnya terbuat dari kaca. Tujuan penyediaan rumah kaca adalah untuk tempat meletakkan pot-pot bibit tanaman, baik bibit yang akan dijadikan bahan kultur jarinang maupun bibit hasil dari kultur jaringan yang sudah siap djual atau dipelihara sendiri.
B. Ruang Tidak Mutlak Steril
* Ruang Planlet.
Ruangan ini menggunakan alat pendingi (AC), maka temperatur ruangan dapat mencapai sekitar 25OC sehingga ideal bagi pertumbuhan planlet. Botol-botol yang berisi planlet jumlahnya dapat mencapai ratusan. Oleh sebab itu, dalam ruangan ini perlu disediakan rak-rak alumuniaum yang dasrnya berlobang-lobang untuk meletakkan botol-botol tersebut secara teratur dan rapi.
* Ruang Inkubator.
Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur jringan perlu dipantau pertumbuhannya setiap hari. Untuk pemantauan ini perlu ruangan khusus yang keadaannya lebih steril dari ruang planlet, yaitu ruang inkubator.
Ruang inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25OC dan harus dilengkapi dengan lampu-lampu neon, karena eksplan yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi membutuhkan temperatru dan cahaya yang dapat diatur dan disesuaikan dengan jenis eksplannya.
* Ruang Shaker dsn Enkas.
Eksplan yang baru ditanam dan diinkubasikan dalam ruang inkubator akan menghasilkan kalus. Bila kalus ini cukup umur, maka dapat diperlukan suspensi sel, yaitu menumbuhkan suatu eksplan atau kalus dengan menggunakan media cair (media yang tidak menggunakan zat pemadat atau agar), kemudian digojok di atas shaker.
Hasil pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam istilah asing disebut plb (protocorm like bodies). Bentuk protocormus adalah bulat-bulat padat dan berwarna hijau. Bila keadaan protocormus sudah keadaan demikian maka sudah siap dipindahkan kedalam media padat untuk di tumbuhkan menjadi planlet.
Enksa juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker, kegunaan enkas ini sama dengan Laminar Air Flow Cabinet, yaitu untuk menabur eksplan.
C. Ruang Mutlak Steril.
* Ruang Penabur.
Ruang penabur biasanya di buat dengan ukuran yang tidak terlalu besar, yaitu 2x3 m2. tujuannya adalah agar pelaksanaan sterilisasi ruangannya tidak membutuhkan waktu yang lama dan tidak mengalami kesulitan.
Dinding ruang penabur dilengkapi dengan porselin, sehingga sterilisasi mudah dilakukan. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 96% dengan hand-sprayer. Sedangkan sterilisasi lantai dengan menggunakan kain pel yang dibasahi alkohol 96%. Sterilisasi ini mutlak harus dilakukan menjelang ruang penabur akan digunakan.
Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan, lampu ultra violet harus dimatkan terlebih dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur diperbolehkan memasuki ruangan tersebut. Sebaiknya, pada saat akan keluar lampu neon di matikan dan setelah keluar menutup daun pintu kembali lampu ultra violet dinyalakan. Dengan demikian steril ruangan dapat dijamin.
5. BAB V (MEDIA TANAM KULTUR JARINGAN)
A. Unsur-unsur yang Dibutuhkan Tanaman
Sebelum menguraikan cara-cara membuat medium kultur jaringan, maka terlebih dahulu kita harus mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman. Unsur-unsur yang dibuthkan tanaman dikelompokkan menjadi:
1. Garam-garam Anorganik
Setiap tanaman membutuhkan paling sedikit 16 unsur untuk pertumbuhannya yang normal. Tiga unsur di antaranya adalah C,H,O yang di ambil dari udara, sedangkan 13 unsur yang lain berupa pupuk yang dapat diberikan melalui akar atau melalui daun. Pada perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Semua unsur tersebut dibutuhkan oleh tanaman untuk pertumbuhannya. Ada unsur yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah besar yang disebut unsur makro, ada pula yang dibutuhkan oleh tanaman dalam jumlah sedikit tetapi harus tersedia yang disebut unsur mikro.
2. Zat-zat Organik
Zat-zat organik yang biasanya ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah sukrosa, mio inositol, asam amino, dan zat pengatur tumbuh. Sedangkan sebagai tambahan biasanya diberi zat organik lain seperti air kelapa, ekstrak ragi, pisang, tomat, toge dan lain-lain.
B. Kegunaan Setiap Unsur Bagi Tanaman
setelah kita mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan oleh tanaman, maka sebelum kita menentukan unsur-unsur yang akan digunakan untuk meramu medium kultur jaringan perlu mengetahui terlebih dahulu kegunaan unsur-unsur tersebut bagi pertumbuhan tanaman atau jaringan tanaman.
1. Unsur Nitrogen (N)
Kegunaan unsur Nitrogen bagi tanaman adalah untuk menyuburkan tanaman, sebab unsur N dapat membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik yang lain.
2. Unsur Fospor (P)
Dibutuhkan oleh tanaman untuk membentuk karbohidrat. Maka, unsur P ini dibutuhkan secara besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih.
3. Unsur Kalium (K)
Memperkuat untuk tubuh tanaman, karena unsur ini dapat digunakan untuk memperkuat serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan buah tidak mudah gugur.
4. Unsur Sulpur (S)
Unsur ini digunakan untuk proses pembentukan anakan sehingga pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin.
5. Unsur Kalsium (Ca)
Digunakan untuk merangsang pembentukkan bulu-bulu akar, mengeraskan batang dan merangsang pembentukkan biji.
6. Unsur Magnesium (Mg)
Digunakan tanaman sebagai bahan mentah untuk ppembentukkan sejumlah protein.
7. Unsur Besi (Fe)
Unsur ini digunakan sebagai penyangga (chelati agint) yang sangat penting untuk menyagga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.
8. Unsur Sukrosa
Unsur ini sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus.
9. Unsur Glukosa atau Fruktosa
Unsur ini dapat digunakan sebagai unsur pengganti sukrosa karena dapat merangsang beberapa jaringan.
10. Unsur Mio-inositol
Penambahan unsur ini pada medium bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan.
11. Unsur Vitamin
Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam mediumklutur jaringan antara lain adalah Thiamin. Thiamin adalah vitamin esensial yang digunakan untuk medium kultur jaringan.
12. Unsur Asam Amino
Unsur ini diunakan oleh tanaman untuk proses pertumbuhan dan diferensiasi sel. Kebutuhan unsur asam amino oleh tanaman berbeda.
13. Unsur Zat Pengatur Tumbuh.
Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senywa organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman terdir dari lima kelompok yaitu, Auksin, Sitokinin, Giberelin, Etilen dan Inhibitor dengan ciri khas dan pengaruh yang berlainan terhadap proses fisiologis.
Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi. Tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium, pertumbuhan sangat terhambat bahkan tidak akan tumbuh sama sekali.
C. Bentuk Fisik Media Tanam
Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula , vitamin, protein, dan hormon tumbuh. media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti campuran-campuran zat kimia dengan air suling, sedangkan media padat adalah media zat cair tesebut ditambah dengan zat pemadat agar.
D. Faktor Lingkungan
1. Keasaman (pH)
Keasaman pH adalah nilai derazat keasaman atau kebasaan dari larutan dalam air. Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H dalam larutan. Nilai di dalam pH berkisar antara 0 (sangat asam) sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk netral adalah pH pada 7.
Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0-6,0. Bila eksplan mulai tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman umumnya akan naik apabila nutrein habis terpakai.
Pengukuran pH dapat dilakukan dengan menggunakan pH meter, atau bila menginginkan yang lebih praktis dan murah dapat digunakan kertas pH. Bila ternyata pH medium masih kurang normal, maka dapat ditambah KOH 1-2 tetes. Sedangkan apabila pH melampaui batas normal dinetralkan dengan penambahan HCL.
2. Kelembapan
Kelembapan relatif (RH) lingkungan biasanya mendekati 100%. RH sekeliling kultur mempengaruhi pola pengembangan. Jadi, pengaturan RH pada keadaan tertentu memerlukan suatu bentuk diferensiasi Khusus.
3. Cahaya
Intensitas cahaya yang rendah dapat mempertinggi embriogenesis dan organogenesis. Cahaya ultra violet dapat mendorong pertumbuhan dan pembentukan tunas dari kalus tembakau pada intesitas yang rendah.
4. Temperatur
Temperatur yang dibutuhkan untuk dapat terjadi pertumbuhan yang optimum umumnya adalah berkisar di antara 200-300C. Sedangkan temperatur yang optimum untuk pertumbuhan kalus endosperm adalah sekitas 250C.
E. Pembuatan Media Tanam
Sebelum membuat medium, maka terlebi dahulu kita harus menentukan medium apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalnya media Vacin Went sangat baik untuk media tumbuh anggrek. Tetapi tidak cocok untuk media tumbuh lain. Untuk eksplan dair tanaman keras sring menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Kundson C cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek.
Untuk membuat media kultur jaringan, biasanya menimbang setiap komponen bahan kimia yang terdapat pada resep medium dasar. Langkah ini kurang praktis karena memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu, timbangan yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Kendala ini dapat diatasi dengan membuat larutan stoc terlebih dahulu, kecuali untuk unsur makronya. Jadi perlu membuat larutan stoc mikro.
6.BAB VI (METODE PELAKSANAAN KULTUR JARINGAN)
A. Metode Kultur Jaringan.
1. Dilihat dari Macam Media Tanam
Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu:
a. Metode Padat (Solid Method)
Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-agar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur jaringan.
Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam. Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus, karena tempat area kalus yaitu pada irisan (jaringan yang luka) tertutup oleh medium.
Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning, untuk menumbuhkan protoplas stelah diisolasikan, untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan).
b. Metode Cair(Liquid Metho)
Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat, karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. Oleh karena itu, penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat yang sesuai.
Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita tidak p erlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein.
2. Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai
Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan, maka metode kultur jaringan yang telah dikenal sekarang antara lain adalah:
1) Kultur meristem.
2) Kultur antera
3) Kultru endosperma
4) Kultur suspensi sel
5) Kultur protoplas
6) Kultur embrio
7) Kultur spora
8) Dan lain-lain
3. Dilihat dari Cara Pemeliharaan
Eksplan yang telah ditanam, agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian menjadi planlet, membutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat. Artinya, eksplan atau kalus yang sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam yang baru harus segera dilaksanakan, tidak boleh sampai terlambat. Pemindahan yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat mengalami brownig atau terkontaminasi oleh jamur atau bakteri.
B. Pelaksanaan Kultur Jaringan
1. Sterilisasi Alat Penabur
Sebelum digunakan, enkas harus diterilisasi dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70%, dengan perbandinga 1:1. setelah disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan.
2. Sterilisasi Alat dan Medium
Alat-alat dissecting –set dan glass ware yang akan digunakan untuk kultur jaringan, setelah dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121 oC, tekanan 15 lb, dan lama sterilsiasi 20-30 menit.
Botol-botol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan alumunium foil, kemudian disterilisasi. Sterilisasi medium lebih sedikit waktunya dibandingkan dengan sterilisasi alat-alat, yakni 15 menit, tetapi suhu dan tekannya sama.
3. Sterilisasi Eksplan
Sterilisasi eksplan dilaksanakan dengan dua cara yaitu:
a. Sterilisasi Eksplan secara Mekanis
Cara ini digunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan membakar eksplan tersebut di atas lampu spirtus sebanyak tiga kali.
b. Sterilisasi Eksplan secara Kimiawi
Sterilisasi ini gunakan untuk eksplan yang lunak. Sterilisasi ini menggunakan bahan kimia. Bahan-bahan yang digunakan untuk sterilisasi:
* Sodium hipoklorit
* Mercuri chlorit
* Alkohol 70%
4. Menabur Eksplan
Menabur eksplan dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan kondisi aseptik. Sebelum kita bekerja di dalam laminar air flow cabinet, semua perhiasan tangan harus dilepas, dan tangan dibasuh terlebih dahulu dengan alkohol 70%.
Eksplan yang siap ditaman dipotng dengan menggunakan scalpel di dlam cawan petri. Potongan eksplan dimasukan kedalam erlenmeyer yang berisi media tumbuh, hingga permukaan yang teriris bersentuhan dengan medium.
Setelah semua pekerjaan menabur selesai, kemudian alat-alat yang sudah dipakai dibersihkan.
5. Melaksanakan Sub-Kultur
Dalam waktu satu sampai dua minggu, eksplan akan tumbuh menjadi kalus. Kalus adalah suatu masa sel yang terbentuk pada permukaan eksplan atau irisan eksplan. Kalus ini akan tumbuh pada media eksplan yang padat., sedangkan pada media cair akan tumbuh plb (protokormus)
Sub-kultur adalah suatu usaha untuk mengganti media kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk kalus atau protokormus dapat terpenuhi.
III. PEMBAHASAN
Dari hasil perbandingan antara buku yang saya buat ini bila dibandingkan dengan buku kultur jaringan yang lain ternyata pada laporan buku yang saya buat ini masih banyak kekurangannya yaitu:
* Masalah-masalah Dalam Kultur Jaringan
Dalam kegiatan kultur jaringan, tidak sedikit masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari bahan yang ditanam, dari lingkungan kultur, maupun dari manusianya.
Permasalahan dalam kultur ada yang dapat diprediksi sebelumnya dan ada pula yang sulit diprediksi kejadiannya. Untuk yang tidak dapat diprediksi, car mengatasinya tidak dapat secara preventif tetapi diselesaikan setelah kasus itu muncul.
Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu:
1) Kontaminasi
Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya.
Penomena kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll).
Upaya mencegah terjadinya kontaminsai.
* Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan.
* Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.
* Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar.
2) Pencoklatan/browning
Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi.
Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan.
3) Vitrifikasi
Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan:
* Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal.
* Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil.
* Pertrumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter
* Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent.
* Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade..
4) Variabilitas Genetik
Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upayapemuliaan tanaman maka variasi genetik adalah kendala. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena:
* Laju multiflikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol
* Penggunaan teknik yang tidak sesuai.
Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur suspensi sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin akibat teknis kultur, media atau hormon.
Cara mengatasi problem variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus memperhatikan aspek yang dikulturkan.
5) Pertumbuhan dan Perkembangan
Problem utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh.
Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel tua yang muda kembali.
Media juag dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya.
Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari sel-sel kalus. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen.
6) Praperlakuan
Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja, pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan.
Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis, fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif pengelolaannya.
7) Lingkunagn Mikro
Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan eksplan, suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan.
Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda, namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya.
Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain.
IV. SIMPULAN
Dari hasil pembuatan laporan buku ini dapat disimpulkan bahwa kultur jaringan. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya.
Manfaat dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul.
Dalam kegiatan kultur jaringan perlu memerlukan bahan-bahan yang dibutuhkan dalam proses kegiatan kultur jaringan. Bahan-bahan yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan diantaranya:
* Unsur hara makro dan mikro
* Zat Pengatur tumbuh
* Aquades
* Vitamin
* Agar
* Gula
* Ekstrak-ekstrak organik (ekstrak air kelapa, ekstrak tomat, dll)
Sumber : Disini
.jpg)
0 komentar:
Posting Komentar